肺癌是当今世界最主要的致死肿瘤疾病，约50%的患者存在EGFR基因突变[1, 2]。这部分患者初次接受第一代和第二代靶向EGFR的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗有较好的应答，但不尽人意的是，约50%的患者在治疗9-14个月后会发生耐药[3, 4]。
第三代EGFR TKI药物osimertinib的出现将患者的中位无病生存期延长至18.9个月，然而，遗憾的是，已有研究表明，20%的患者会出现中枢神经系统肿瘤转移，并最终影响患者的生活质量，甚至缩短生存期[5, 6]。因此，阐明使用osimertinib后患者出现中枢神经系统转移复发的机制，就显得至关重要。
近期，由来自哥伦比亚大学的Anup Kumar Biswas和Swarnali Acharyya率领的研究团队，利用免疫缺陷小鼠模拟osimertinib治疗后肺癌脑转移，发现脑部转移的肺癌细胞高表达S100A9，并通过ALDH1A1-RA轴促进细胞存活。他们还证实，敲低相关基因的表达或使用RAR抑制剂均可有效抑制osimertinib耐受性肺癌细胞在脑部的生长[7]。
这一重要研究结果近期发表于著名期刊Cancer Discovery上。
论文首页截图
接下来，咱们就一起来看看Biswas团队是如何开展这项研究的。
Biswas团队首先利用含EGFR第19号外显子缺失的人肺癌细胞系PC9-BrM3构建免疫缺陷小鼠脑转移模型，尽管osimertinib治疗能够有效延长无脑转移生存期，但所有小鼠终究难逃脑转移甚至死亡的厄运，这与临床患者经治疗后出现的情况是一致的。
osimertinib治疗237天后肺癌细胞脑转移（左图）；
osimertinib治疗后小鼠无脑转移生存期（右图）
为探索其中原因，Biswas团队分离出上述经osimertinib治疗的小鼠脑部转移肿瘤细胞（PC9-Tr-BrM），并注射到新一批小鼠体内，随后用osimertinib治疗。结果他们发现，与注射PC9-BrM的小鼠相比，osimertinib治疗反而会加快PC9-Tr-BrM小鼠的脑部肿瘤进展。这说明，osimertinib对于已转移至脑部并出现耐药的肺癌细胞束手无策。
为探究机制，Biswas团队对PC9-BrM和PC9-Tr-BrM细胞进行了定量质谱和转录组学分析，结果显示S100A8和S100A9在PC9-Tr-BrM细胞中高水平表达。进一步的功能实验表明，高表达S100A9的肺癌细胞具备更强的脑转移能力，初步表明了S100A9是促进EGFR突变肺癌细胞脑转移的“反派头目”身份。
脑转移肺癌细胞（Tr-BrM）和肺癌细胞（BrM）的S100A9表达（左图）；敲低S100A9的肺癌细胞与对照细胞注射于小鼠后脑部荧光检测（右图）
为进一步探究S100A9的角色，Biswas团队先分选出高表达和低表达S100A9的肺癌细胞，然后将这些细胞分别注射给不同的小鼠。结果显示，注射高表达S100A9肺癌细胞的小鼠出现更严重的脑部转移现象，坐实了S100A9的“始作俑者”身份，同时提示osimertinib治疗过程中，高表达S100A9的肺癌细胞可以存活下来并为脑部转移做准备。
为了探索S100A9是如何影响肺癌细胞存活增殖的，Biswas团队敲低了肺癌细胞中S100A9的表达，并将其与对照细胞进行RNA测序分析。结果显示，低表达S100A9的细胞中ALDH1A1表达也显著降低。随后，他们证实S100A9是通过上调ALDH1A1的表达，进而促进肺癌细胞的存活和脑转移。
基于上述测序结果，他们还发现S100A9能够促进维A酸（RA）代谢通路的激活，且RA通路重要酶分子ALDH1A1参与S100A9依赖的肺癌细胞脑转移。因此他们认为，RA通路激活可能是促进osimertinib治疗后脑转移肿瘤细胞增殖的重要因素。随后，他们利用RA受体（RAR）抑制剂AGN-194310验证了上述假设。
分别于小鼠注射两种肺癌细胞系（Tr-BrM）后用osimertinib和RAR抑制剂治疗，脑转移情况检测
考虑到肿瘤实际发展过程中肿瘤细胞的异质性，Biswas团队将未经分选的PC9-BrM细胞注射于小鼠构建脑转移模型，并联合使用osimertinib和RAR抑制剂治疗，结果不负众望，与未经治疗组或单一用药组相比，二者联合可达到最大程度清除脑部残留肿瘤细胞的效果。
PC9-BrM小鼠体内成瘤后联合应用osimertinib和RAR抑制剂治疗，脑组织切片CK7染色
除上述结果外，Biswas团队也通过实验证明了S100A9-ALDH1A1轴对于肺癌细胞脑部转移的特异性，即肺组织内以及转移到骨组织的肺癌细胞的存活增殖并不依赖于S100A9-ALDH1A1轴。同时，他们收集了EGFR突变肺癌患者的肺癌组织样本，并检测S100A9的表达，结果发现肿瘤细胞内S100A9表达水平与患者脑转移和更短的无复发生存期存在正向相关性。
总的来说，Biswas团队基于临床中45%的EGFR突变肺癌患者出现脑转移这一现象，以及目前第三代药物osimertinib的应用情况，利用免疫缺陷小鼠构建肺癌脑转移模型及一系列实验揭示了，S100A9是osimertinib耐药的肺癌细胞进行脑转移的“特派联络员”，它通过调控ALDH1A1-RA轴从而促进肿瘤细胞在脑部的存活和增殖。
当然，这个研究也落实到了诊断和治疗层面，提示了osimertinib治疗前肿瘤细胞内S100A9的表达情况可预测治疗后脑转移发生的风险，osimertinib与RAR抑制剂的联合应用能够提升脑部转移肿瘤细胞的清除效率。
参考文献：
1.H. Sung, J. Ferlay, R. L. Siegel, M. Laversanne, I. Soerjomataram, A. Jemal, et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-49.
2.Y. Shi, J. S. Au, S. ThongpRASert, S. Srinivasan, C. M. Tsai, M. T. Khoa, et al. A prospective, molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology (PIONEER). J Thorac Oncol. 2014;9(2):154-62.
3.J. Rotow, T. G. Bivona. Understanding and targeting resistance mechanisms in NSCLC. Nat Rev Cancer. 2017;17(11):637-58.
4.J. G. Paez, P. A. Janne, J. C. Lee, S. Tracy, H. Greulich, S. Gabriel, et al. EGFR mutations in lung cancer: cORRelation with clinical response to Gefitinib therapy. Science. 2004;304(5676):1497-500.
5.S. S. Ramalingam, J. Vansteenkiste, D. Planchard, B. C. Cho, J. E. Gray, Y. Ohe, et al. Overall Survival with Osimertinib in Untreated, EGFR-Mutated Advanced NSCLC. N Engl J Med. 2020;382(1):41-50.
6.Z. Piotrowska, H. Isozaki, J. K. Lennerz, J. F. Gainor, I. T. Lennes, V. W. Zhu, et al. Landscape of Acquired Resistance to Osimertinib in EGFR-Mutant NSCLC and Clinical Validation of Combined EGFR and RET Inhibition with Osimertinib and BLU-667 for Acquired RET Fusion. Cancer Discov. 2018;8(12):1529-39.
7.A. K. Biswas, S. Han, Y. Tai, W. Ma, C. Coker, S. A. Quinn, et al. Targeting S100A9-ALDH1A1-retinoic acid signaling to suppress brain relapse in EGFR-mutant lung cancer. Cancer Discov. 2022.
